Buněčná (plazmatická) membrána (PM) plní funkci ochranné bariéry, ale uplatňuje se také v rámci buněčné komunikace. Integrita hydrofobního lipidového prostředí PM je významným faktorem ovlivňujícím funkci membránových proteinů.
Rozhodující vliv na strukturní a dynamické parametry PM má cholesterol. Cholesterol je rovněž důležitou složkou membránových domén, které se podílí na regulaci distribuce a funkce membránových proteinů, GPCR nevyjímaje. Pomocí biochemických metod studujeme úlohu membránových domén v signalizaci GPCR. Paralelně provádíme analýzu struktury a funkce buněčné membrány pomocí metod fluorescenční spektroskopie (stanovení polarizace, dynamické depolarizace a dohasínání fluorescence).
Vliv narušení integrity plazmatické membrány na mobilitu GPCR v živých buňkách studujeme pomocí pokročilých metod fluorescenční mikroskopie, jako jsou Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) nebo Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS), jak ilustruje obr. 1 – viz práce Brejchová a spol. (2015) zabývající se vlivem deplece cholesterolu na mobilitu a funkci receptoru pro thyreoliberin (TRH-R).
Pomocí fluorescenční mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) jsme rovněž studovali vliv deplece cholesterolu na internalizaci δ-opioidního receptoru (δ-OR). Výsledky této studie, které byly nedávno publikovány (Brejchová a spol., 2016), znázorňuje obr. 2. (Pro další podrobné infomace viz také Brejchová a spol., 2011; Ostašov a spol., 2013; Roubalová a spol., 2015 a PhD práce J. Brejchové, 2014.)
Obr. 1. Vliv deplece cholesterolu na mobilitu a funkci TRH-R
Levý panel: Distribuce TRH-R v buňkách linie HEK293 stabilně exprimujících fúzní protein mezi TRH-R a zeleným fluorescenčním proteinem (TRH-R-eGFP) před (control) a po depleci cholesterolu navozené inkubací buněk s β-cyklodextrinem. Prostřední panel: Hodnoty zdánlivého difuzního koeficientu (Dapp) TRH-R-eGFP v živých buňkách za kontrolních podmínek (CTR) a po depleci cholesterolu (β-CDX), který byl stanoven metodou FRAP. Pravý panel: Výsledek analýzy vlivu deplece cholesterolu na schopnost TRH-R aktivovat trimerní G proteiny získaný stanovením vysokoafinní vazby [35S]GTPγS.
Obr. 2. Vliv deplece cholesterolu na agonistou navozenou internalizaci δ-OR – buňky HEK293 přechodně exprimující FLAG-δ-OR
Levý panel: Reprezentativní mikroskopické snímky znázorňující distribuci FLAG-δ-OR v kontrolních buňkách (control) a dále v buňkách, které byly vystaveny působení β-cyklodextrinu (β-CDX), agonisty (DADLE) nebo obou látek současně (DADLE + β-CDX). Pravý panel: Hodnoty frakce internalizovaných receptorů (%) získané kvantifikací mikroskopických snímků pomocí programu ImageJ.