Intranet Areál web

Publikace

Odhalení nových regulačních mechanismů v lidském antiporteru Na+/H+ NHA2 (14.11. 2022)

Sodno/protonové antiportery jsou membránové proteiny, které se nacházejí ve všech živých buňkách od bakterií až po člověka a hrají důležitou úlohu v regulaci pH a koncentrací kationtů uvnitř buněk. Mezi tyto typy transportérů patří i antiporter NHA2, jehož aktivita ovlivňuje řadu fyziologických funkcí, např. sekreci inzulínu, zpětné vstřebávání sodíku v ledvinách nebo pohyblivost spermií. Antiporter NHA2 transportuje přes membránu kationty Na+ nebo Li+ výměnou za H+ a jeho aktivita je specificky inhibována phloretinem. Vlastnosti a funkce všech proteinů přímo vyplývají z jejich složení, tedy ze sekvence aminokyselin, které protein tvoří. V rodině antiporterů Na+/H+ má NHA2 jedinečnou strukturu. Skládá se z 537 aminokyselin uspořádaných do 14ti transmembránových domén a unikátního hydrofilního N-konce dlouhého 82 aminokyselin, jehož struktura a funkce nebyly dosud studovány. V časopise Protein Science jsme publikovali objev nových prvků ve struktuře NHA2 důležitých pro jeho funkci, včetně odhalení významné regulační úlohy N-konce proteinu.

Lidský protein NHA2 a jeho mutantní varianty jsme studovali pomocí jeho exprese v buňkách modelového eukaryotního organismu, kvasince Saccharomyces cerevisiae, a také pomocí bioinformatických simulací (ve spolupráci s laboratoří Prof. Nira Ben-Tala z Univerzity v Tel-Avivu). Identifikovali jsme několik nových aminokyselinových zbytků důležitých pro selektivitu antiporteru (rozpoznání a transport kationtů Na+ a Li+) a pro transport protonů. Dále jsme určili místo ve struktuře proteinu, kam se váže inhibitor phloretin. Odhalili jsme také, že unikátní hydrofilní N-koncová část proteinu má důležitou (autoinhibiční) úlohu v regulaci transportní aktivity NHA2, protože zkrácení N-konce o prvních 50-70 aminokyselin vedlo až k dvojnásobnému zvýšení transportní aktivity proteinu. Dosažené výsledky také ukazují, že expresní systém NHA2 v buňkách kvasinek je možné v budoucnu využít např. pro rychlé zjištění, jak mutace vyskytující se v NHA2 v lidském genomu ovlivňují aktivitu antiporteru a/nebo pro testování nových látek ovlivňujících funkci NHA2 podobně jako phloretin.

 

Velazquez D., Prusa V., Masrati G., Yariv E., Sychrova H., Ben-Tal N. and Zimmermannova O. (2022): Allosteric links between the hydrophilic N-terminus and transmembrane core of human Na+/H+ antiporter NHA2. Protein Sci: e4460. IF = 6.993 DOI

Charakterizace nové látky pro léčbu obezity s nižšími vedlejšími účinky na metabolismus kostí (7.11. 2022)

NOVÁ PUBLIKACE

Thiazolidindiony (TZD) jsou látky používané při léčbě diabetu, které zvyšují citlivost k inzulínu. První generace TZD však vykazuje řadu nežádoucích účinků, včetně např. zvýšené tvorby velkých tukových buněk (adipocytů) v kostní dřeni spojené s vyšším rizikem zlomenin a úbytku kostní hmoty. Předpokládá se, že tyto vedlejší účinky jsou do jisté míry způsobeny silnou vazbou TZD na jaderný receptor PPARγ. V nové studii publikované v časopise Molecular Metabolism jsme zkoumali, jak metabolismus v kostech ovlivní podávání látky MSDC-0602K, nového analoga TZD s nižší afinitou k receptorům PPARγ.

Zjistili jsme, že podávání MSDC-0602K obézním myším po dobu 8 týdnů vedlo ve srovnání s původními TZD k výrazně lepší kostní struktuře a vyšší pevnosti kostí spolu se zvýšeným podílem menších adipocytů v kostní dřeni. Zkoumali jsme také působení látky MSDC-0602K na molekulární úrovni pomocí pokusů s primárními tkáňovými kulturami. Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně z myší ošetřených MSDC-0602K diferencovaly ve zvýšené míře do podoby osteoblastů (kostních buněk), nepodléhaly tolik stárnutí a vykazovaly zvýšený buněčný metabolismus glutaminu, který je důležitý pro tvorbu kostí (osteogenezi).

Ze studie vyplývá, že nový analog TZD by mohl ve srovnání s původními TZD zvyšovat citlivost k inzulínu s nižšími nežádoucími účinky na kvalitu kostí a metabolismus mezenchymálních kmenových buněk. Látka MSDC-0602K by tak mohla nahradit starší léčiva při léčbě metabolických a kostních onemocnění.

 

 

Benova, A., M. Ferencakova, K. Bardova, J. Funda, J. Prochazka, F. Spoutil, T. Cajka, M. Dzubanova, T. Balcaen, G. Kerckhofs, W. Willekens, G. H. van Lenthe, G. Alquicer, A. Pecinova, T. Mracek, O. Horakova, M. Rossmeisl, J. Kopecky and M. Tencerova (2022). "Novel thiazolidinedione analog reduces a negative impact on bone and mesenchymal stem cell properties in obese mice compared to classical thiazolidinediones." Mol Metab 65: 101598. IF = 8.568 DOI

Struktura steroidů zásadně ovlivňuje jejich vliv na aktivitu N-metyl-D-aspartátových receptorů (20.10. 2022)

NOVÁ PUBLIKACE

N-metyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou proteiny, které se účastní regulace mnoha procesů v mozku savců. Hrají klíčovou roli při přenosu signálu mezi nervovými buňkami a i malé narušení funkce těchto receptorů může mít závažné následky pro zdraví člověka. Snížená funkce NMDA receptorů je spojována s neuropsychiatrickými poruchami jako je mentální retardace, snížený intelekt, schizofrenie, poruchy autistického spektra, epilepsie, nebo poruchy motoriky. Mezi látky, které dokáží napravit sníženou funkci NMDA receptorů patří například steroidy. Mechanismus účinku steroidů, kterým posilují funkci NMDA receptorů, však nebyl dosud popsán.

Ve studii publikované v časopise British Journal of Pharmacology jsme zjišťovali vliv nově syntetizovaných steroidů odvozených od neurosteroidu pregnanolon sulfátu na regulaci funkce NMDA receptorů. Ukázali jsme, že steroidy s krátkými alifatickými řetězci, jako je například pregnanolon karboxylát (PA-Car), inhibují funkci NMDA receptorů, zatímco steroidy s delšími řetězci, jako epipregnanolon butyrát (EPA-But), funkci NMDA receptorů posilují. Pomocí výsledků získaných z elektrofyziologických měření, molekulárně biologických metod a počítačového modelování jsme odhalili vazebné místo v transmembránové doméně NMDA receptoru, kam se váže EPA-But a navrhli jsme mechanismus, kterým EPA-But posiluje funkci NMDA receptorů.

 

 

(A) Vlevo: struktury pregnanolon karboxylátu (PA-Car) and epipregnanolon butyrátu (EPA-But). Vpravo: sloupcový graf ukazuje inhibiční působení PA-Car a posilující působení EPA-But na NMDA receptory. (B) Vazebné místo pro EPA-But (zelená molekula) se nachází na transmembránové doméně NMDA receptoru. Aminokyselinové zbytky, které se účastní interakce NMDA receptoru s EPA-But jsou zvýrazněny červeně.

Kysilov B, Hrcka Krausova B, Vyklicky V, Smejkalova T, Korinek M, Horak M, Chodounska H, Kudova E, Cerny J, Vyklicky L: Pregnane-based steroids are novel positive NMDA receptor modulators that may compensate for the effect of loss-of-function disease-associated GRIN mutations. British Journal of Pharmacology, (2022) 179:15, 3970–3990, IF = 9.473,  DOI

Iontový kanál TRPC5 jako cíl pro léčbu neuropatické bolesti (19.10. 2022)

Diabetickou neuropatii a neuropatii vyvolanou chemoterapií doprovází bolestivé stavy, jejichž možnosti léčby jsou, navzdory velkému pokroku v medicíně, nedostatečné. Tyto typy neuropatií se projevují bolestí vyvolanou chladem, kterou je v klinické praxi velmi obtížné zvládnout. Prozatím jediný lék, který úspěšně prošel klinickými studiemi a prokázal účinnost na tento typ bolesti, je duloxetin. Tento lék je účinnější než jiná antidepresiva s podobným mechanismem účinku při zvládání bolestivých neuropatií, ale není známo proč. Zaujalo nás, že u chladově citlivého iontového kanálu TRPC5 bylo v nedávné době prokázáno, že je exprimován v lidských senzorických neuronech a že inhibice jeho aktivity zmírňuje přetrvávající bolest, včetně neuropatické bolesti vyvolené chladem.

V naší studii jsme si položili otázku, zda je kanál TRPC5 modulován duloxetinem a zda může přispívat k jeho analgetickému účinku. Naše elektrofyziologická měření ukázala, že aktivita kanálu TRPC5 je duloxetinem silně tlumena. Díky molekulárnímu dokování a molekulárně dynamickým simulacím jsme nalezli možné vazebné místo duloxetinu. Tato vazebná kapsa na intracelulární straně transmembránové domény TRPC5 byla následně ověřena pomocí bodové mutageneze. Tvar a elektrostatické prostředí vazebné kapsy jsme mírně změnili nahrazením aminokyseliny glutamát 418 alaninem, což vedlo k úplné ztrátě účinku duloxetinu na aktivaci TRPC5 vyvolanou napětím. Naše výsledky naznačují, že TRPC5 představuje dříve nerozpoznaný molekulární cíl pro běžně používaný a vysoce účinný lék proti závažným formám bolesti.

 

 

Zimova L, Ptakova A, Mitro M, Krusek J,Vlachova V: Activity dependent inhibition of TRPC1/4/5 channels by duloxetine involves voltage sensor-like domain, Biomedicine & Pharmacotherapy. Roč. 152, August 2022, 113262, IF = 7,419, DOI

Nové druhy lipidů v mateřském mléce (29.7. 2022)

NOVÁ PUBLIKACE

Kojení je nejlepší forma výživy pro novorozené dítě. Mateřské mléko obsahuje ideální koktejl živin a biologicky aktivních látek, které jsou nezbytné pro rychlý růst a vývoj v tomto časném období lidského života. Složení mléka je ovlivněno celou řadou faktorů, jako jsou například stravovací návyky matky, způsob porodu nebo délka těhotenství a důležitou otázkou neonatologické péče je právě optimální složení mléka pro nedonošené děti.

V naší studii jsme sledovali, jaký vliv má předčasný porod a nebo porod císařským řezem na kvalitu prvotního mléka – mleziva. Analýza vzorků od dárkyň mléka z Ústavu pro péči o matku a dítě v Praze Podolí ukázala, že oba typy porodu mají mírně nepříznivý dopad na složení mleziva. V těchto případech neměla mléčná žláza matky dostatek času k zahájení tvorby plnohodnotného mléka, ale s časem tento negativní vliv mizí a zralé mateřské mléko se podobá svým složením mléku matek s přirozeným porodem v termínu.

Ve všech vzorcích mateřského mléka jsme navíc objevili speciální lipidy zvané triacylglycerol estolidy, které slouží jako zásobárna protizánětlivých molekul. Zjistili jsme, že mléčný enzym karboxyl ester lipáza umí tyto složité molekuly štěpit, a uvolňovat tak látky s prospěšným účinkem na zdraví novorozence.

Brejchová K, Palůchová V, Březinová M, Čajka T, Balas L, Durand T, Křížová M, Straňák Z, Kuda O: Triacylglycerols containing branched palmitic acid ester of hydroxystearic acid (PAHSA) are present in the breast milk and hydrolyzed by carboxyl ester lipase, Food Chemistry. 2022; 388(Sep 15)); 132983, IF = 9.231 DOI

Rytmické chování matky podporuje vývoj biologických hodin plodu (27.5. 2022)

Než začnou samy tikat vnitřní biologické hodiny plodu v suprachiasmatických jádrech (SCN) hypotalamu, ovlivňuje funkci a vývoj této struktury rytmické chování matky. To bylo zjištěno v nové studii publikované týmem Aleny Sumové z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR 24. května v časopise PLOS Biology. Tento objev významně přispívá k pochopení vývoje vnitřních hodin a může nalézt uplatnění při léčbě předčasně narozených dětí.

SCN jsou centrálními hodinami v našem těle, poháněné rytmickým spínáním a vypínáním hodinových genů. Rytmická aktivita hodinových genů v buňkách SCN řídí aktivitu mnoha dalších genů lokálně i jinde v těle, což v konečném důsledku ovlivňuje širokou škálu cirkadiánních rytmů v chování, včetně příjmu potravy a spánku. Tato autonomní rytmická genová aktivita SCN však začíná relativně pozdě ve vývoji plodu, což vyvolává otázku, zda předtím než se vyvine, mohou genovou aktivitu v SCN ovlivňovat mateřské signály.

Aby autoři tuto otázku prozkoumali, porovnali denní profily genové aktivity v SCN z plodů vyvíjejících se u březích potkanů ​​držených ve tmě za dvou různých podmínek. Kontrolní skupina matek měla intaktní SCN a volný přístup k potravě, zatímco druhá skupina matek měla SCN chirurgicky odstraněné a měla omezený přístup k potravě na osm hodin denně, aby její pohybová aktivita vykazovala cirkadiánní rytmus i v nepřítomnosti centrálních hodin. Pomocí biostatistických analýz vědci zjistili, že v SCN plodů obou skupin existovala malá sada genů, jejichž načasování se mezi těmito dvěma skupinami lišilo, a mnohem větší soubor genů, jejichž aktivita oscilovala ve vzájemné synchronizaci. Mnohé z těchto genů mohly být přiřazeny ke dvěma hlavním neuronálním procesům. První odráží pokračující vývoj SCN a druhý nejranější projev jejich pozdější funkce. Data naznačují, že při vývoji fetálních SCN mohou mateřské stimuly nahradit chybějící mezibuněčnou synaptickou komunikaci a řídit rytmy buněčných populací dříve, než hodiny SCN plně dozrají. Nečekaná rozsáhlost a specifičnost reakce buněk SCN na mateřské signály zdůrazňuje důležitost fungujících biologických hodin matky během těhotenství a poukazuje na potenciální dopad absence takových signálů u předčasně narozených dětí.

Greiner P., Houdek P., Sládek M., Sumová A.: Early rhythmicity in the fetal suprachiasmatic nuclei in response to maternal signals detected by omics approach. PLOS Biology; DOI, IF 8.029 Published: May 24, 2022  

Nové poznatky o struktuře komplexu FOXO4: p53 – klíčového faktoru v regulaci stárnutí buněk (22.4. 2022)

Transkripční faktor p53 brání tomu, aby se vlivem stresu staly z normálních buněk buňky nádorové. Za stresových podmínek p53 interaguje s dalším transkripčním faktorem FOXO4 (Forkhead box O 4) a společně pak zvyšují produkci proteinu p21, což spouští proces stárnutí buňky (senescenci). Molekulární mechanismus zvyšování transkripce p21 je však stále nejasný. V práci  publikované v časopise Protein Science vědecké týmy Dr. Obšilové (FGÚ AV ČR), prof. Obšila (PřF UK a FGÚ AV ČR) a jejich kolegů z ÚOCHB AV ČR charakterizovali vzájemné interakce proteinů p53 a FOXO4 na molekulární úrovni. Nové poznatky o struktuře komplexu naleznou využití při vývoji specifických inhibitorů interakce mezi oběma proteiny, a následně pak při vývoji nových léčiv zaměřených na selektivní eliminaci senescentních buněk.

V této strukturní studii vědci provedli podrobnou charakterizaci interakcí v komplexu FOXO4:p53 pomocí integrovaného přístupu zahrnujícího analytickou ultracentrifugaci, nukleární magnetickou rezonanci a chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií. Protože FOXO4 i p53 mají více domén (viz. obrázek), studovali roli jednotlivých domén a neuspořádaných segmentů obou proteinů a zmapovali jejich interakční rozhraní. Zjistili, že zcela zásadní pro celkovou stabilitu komplexu p53:FOXO4 je interakce mezi transaktivační doménou TAD p53 a Forkhead doménou FOXO4. Na tvorbě komplexu se dále podílejí kontakty zahrnující N-koncový neuspořádaný segment FOXO4, C-koncovou negativní regulační doménu p53 a DNA-vazebné domény obou proteinů. Měřením vazby na DNA dále zjistili, že tvorba komplexu p53:FOXO4 blokuje vazbu p53 na DNA, aniž by však ovlivnila DNA-vazebné vlastnosti FOXO4.

 

Vlevo, analýza interakce mezi FOXO4 a p53 pomocí analytické ultracentrifugace, metodou sedimentační rychlosti. Uprostřed, změny v chemických posunech 15N-značeného FOXO4 v přítomnosti p53 získané z 1H-15N HSQC spekter namapované na krystalovou strukturu komplexu FOXO4 DBD:DNA. Vpravo, měření změn anisotropie fluorescence ukazující, že tvorba komplexu inhibuje vazbu p53 na DNA.

 

Mandal R, Kohoutova K, Petrvalska O, Horvath M, Srb P, Veverka V, Obsilova V and Obsil T. FOXO4 interacts with p53 TAD and CRD and inhibits its binding to DNA. Protein Sci. roč. 31, č. 5 (2022), č. článku e4287. IF = 6.725. DOI

Metabolomický atlas myši (14.1. 2022)

Orální glukózový toleranční test (OGTT) je nejběžněji používaným nástrojem na diagnostiku cukrovky z kapky krve. Pomocí něj můžeme sledovat schopnost organismu snížit hladinu cirkulující glukózy, která byla podána nalačno. Přestože jsou dynamické změny hladiny glukózy v krvi během OGTT dobře známy, málo se ví o metabolických změnách v cílových orgánech nebo o jejich vzájemné komunikaci. V naší studii jsme zkoumali, co se děje s molekulami cukru v jednotlivých orgánech a jak cukr ovlivňuje metabolické dráhy v těle. Proto jsme na myším modelu provedli OGTT s využitím glukózy značené stabilním izotopem uhlíku (13C), analyzovali jsme distribuci 13C6-glukózy v tkáních a sledovali časové profily metabolitů a lipidů napříč 12 orgány a v plasmě. Zjistili jsme, že se během OGTT využití glukózy zapíná na úrovni jednotlivých orgánů se specifickou kinetikou, ale substráty hladovění, jako je β-hydroxybutyrát, jsou “vypnuty” ve všech orgánech najednou. Časové profily 13C značených mastných kyselin a triacylglycerolů v tkáních naznačují, že se hnědá tuková tkáň může výrazně podílet na hladinách cirkulujících mastných kyselin paradoxně v momentě, kdy jsou hodnoty glukózy v plazmě nejvyšší. Vytvořili jsme virtuální interaktivní atlas metabolitů (cukrů, aminokyselin, lipidů..), který popisuje vzájemné vztahy mezi orgány po požití dávky cukru. Metabolický osud glukózy byl sledován ve 12 tkáních a plasmě.

Navštivte interaktivní webovou aplikaci, kde můžete virtuální myš prozkoumat sami.

Lopes M, Brejchova K, Riecan M, Novakova M, Rossmeisl M, Cajka T, Kuda O. Metabolomics atlas of oral 13C-glucose tolerance test in mice. Cell Rep. 2021 Oct 12;37(2):109833. DOI. PMID: 34644567 IF = 9,423

Účinnost opioidních analgetik je potlačena chemokinem CCL2 (8.12. 2021)

Opioidní analgetika jsou standardně využívána při léčbě závažných bolestivých stavů. Velmi obtížná je ale léčba neuropatických bolestí, které vznikají při poškození nervového systému a opioidní analgetika jsou zde často neúčinná. Je známo, že za těchto neuropatických stavů dochází na úrovni míchy k zánětu a zvýšené produkci určitých signálních molekul (chemokinů), jako je CCL2. Současná práce ukazuje, že chemokin CCL2 je jedním z důležitých faktorů významně snižujících účinnost analgetik působících přes opioidní receptory. Pravděpodobně působí jak přímo na neurony, tak přes aktivaci mikrogliových buněk. Léčba opioidními analgetiky je spojena také s celou řadou závažných nežádoucích účinků. Jedním z nich je i paradoxní zvýšená bolestivost – hyperalgezie, po podání opioidů. Tato práce ukazuje, že zmíněná nežádoucí hyperalgezie může být způsobena aktivací TRPV1 receptorů. Celkově publikované výsledky naznačují, že cestou ke zlepšení účinnosti léčby opioidními analgetiky, zejména při neuropatických stavech, by mohlo být současné ovlivnění funkce chemokinu CCL2 a TRPV1 receptorů.

Vliv CCL2 na utlumení bolestivého (nociceptivního) signálu opioidními agonisty v zadním rohu míšním. Kontrolní modrá křivka ukazuje, jak je synaptický přenos nociceptivního signálu po přidání látky DAMGO výrazně utlumen a zhruba po 13 minutách naopak posílen. DAMGO je agonista µ opiodních receptorů a napodobuje tedy účinek opiodních analgetik. Analgetický účinek DAMGO je však zcela potlačen v přítomnosti chemokinu CCL2 (červená křivka). Fialová křivka ukazuje, že CCL2 působí prostřednictvím mikrogliálních buněk, protože ztrácí svůj účinek, pokud jsou mikroglie blokovány přídavkem minocyklinu.

Chemokine CCL2 preventsopioid‑inducedinhibitionofnociceptivesynaptictransmission in spinalcorddorsalhorn. Mario Heles, Petra Mrozkova, Dominika Sulcova, Pavel Adamek, Diana Spicarova and Jiri Palecek, JournalofNeuroinflammation (2021) 18:279, DOI, IF=8.23

Oddělení výzkumu bolesti, Fyziologický ústav AV ČR, Akademie věd České republiky, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4, Česká republika

Glifloziny – víc než jen antidiabetika (8.12. 2021)

Glifloziny se dnes běžně předepisují jako léčiva proti diabetu (pacienti možná budou znát např. empagliflozin pod obchodním názvem Jardiance). Glifloziny inhibují činnost transportéru pro sodík  a glukózu  v ledvinách, čímž zvyšují vylučování glukózy močí a pomáhají tak udržet hladiny krevního cukru. Vedle úlevy od zvýšené glykémie byla u pacientů pozorována i řada dalších příznivých účinků gliflozinů mj. snížení hmotnosti, krevního tlaku, či funkce ledvin a to nejen u lidí s diabetem ale i bez diabetu. Jak je to možné? Tady nastala ta pravá chvíle udělat krok zpět a charakterizovat účinky těchto léků znovu a důkladně u modelových zvířat. Výzkumný tým dr. Vaněčkové a její kolegové z dvou dalších oddělení z Fyziologického ústavu ve spolupráci s dr. Malínskou z IKEM zkoumali účinky empagliflozinu u různých nediabetických potkaních modelů vyznačujících se sklony k vysokému krevnímu tlaku (Ren-2 transgenní potkani, TGR) nebo k poruchám lipidového metabolismu (hereditárně triglyceridemičtí potkani). Ačkoli se přínos léčby u jednotlivých modelů v detailech lišil, dosažené výsledky ukazují, ze empagliflozin působí protizánětlivě, normalizuje hladiny krevních i tkáňových lipidů a u TGR potkanů navíc tlumí aktivitu sympatického nervového systému, čímž dochází ke snížení krevního tlaku. Tyto poznatky mohou v budoucnu přispět k rozšíření použití gliflozinu i na jiné diagnózy, než je stávající diabetes.

 

 

Hojná S, Rauchová H, Malínská H, Marková I, Hüttl M, Papoušek F, Behuliak M, Miklánková D, Vaňourková Z, Neckář J, Kadlecová M, Kujal P, Zicha J, Vaněčková I. Antihypertensive and metabolic effects of empagliflozin in Ren-2 transgenic rats, an experimental non-diabetic model of hypertension. Biomed Pharmacother. 2021 Dec;144:112246. Epub 2021 Oct 1. IF-5,98, DOI

Načíst další