Intranet Areál web

Publikace

Schopnost transportovat kationty K+ a tím i fyziologickou úlohu Na+/H+ antiporterů ovlivňuje složení jejich hydrofilních C-konců (31.1. 2024)

Pro každou buňku je důležité neustále kontrolovat iontové složení svého vnitřního prostředí (cytoplasmy). Má-li odolávat vysokým koncentracím solí (např. NaCl), musí být schopna se zbavovat kationtů sodíku (Na+). Výstup kationtů draslíku (K+) ven z buňky zase souvisí s regulací vnitrobuněčného pH a membránového potenciálu. Transport těchto kationtů ven z buňky výměnou za protony zajišťují v buňkách všech eukaryotických organismů, od jednobuněčných kvasinek až po člověka, tzv. Na+/H+ antiportery. Pro případné farmakologické zásahy do iontové rovnováhy buňky je nutné rozluštit na molekulární úrovni, jak struktura antiporteru ovlivňuje jeho funkce.

Na+/H+ antiportery se jako většina membránových proteinů skládají z části, která se nachází v membráně a části orientované do cytoplasmy - hydrofilního C-konce (viz. obrázek). Dosud se předpokládalo, že to, které ionty budou antiporterem přenášeny, určuje pouze transmembránová část. V naší nové práci však demonstrujeme, že pro určení substrátové specificity (zejména schopnosti transportovat K+) je důležité i složení hydrofilního C-konce antiporteru.  

Pro studii jsme konkrétně využili jednobuněčný modelový organismus eukaryotních buněk – kvasinku Saccharomyces cerevisiae, ve které jsme exprimovali antiporter Sod2-22 z osmotolerantní kvasinky Zygosaccharomyces rouxii, který účinně exportuje z buněk pouze kationty Na+ a Li+, ale ne K+. Zjistili jsme, že záměna pouze jedné aminokyseliny (zavedení záporně nabitého zbytku nebo odstranění kladně nabitého zbytku) v jedné z C-koncových konzervovaných oblastí (C3) umožnila tomuto antiporteru transportovat i K+. Zkrácení nebo nahrazení C-terminální části ZrSod2-22 C-koncem z jiného K+-transportujícího antiporteru (S. cerevisiae Nha1 nebo Z. rouxii Nha1) také vedlo k antiporteru s kapacitou exportovat K+. Tato práce poskytuje řadu nových poznatků o vztahu mezi strukturou a funkcí v rodině Na+/H+ antiporterů v eukaryotních buňkách.

 

Vlevo: Topologický model Na+/H+ antiporteru z kvasinky Z. rouxii s vyznačenými konzervovanými doménami v hydrofilním C-konci. Vpravo: Mutace jednotlivých zbytků v konzervované doméně C3 změnily substrátovou specifitu antiporteru a umožnily mu zprostředkovat export K+ (demonstrováno růstem buněk exprimujících tyto mutované verze v přítomnosti KCl).

Zimmermannova O., Velazquez D., Papouskova K., Prusa V., Radova V., Falson P., Sychrova H.: The hydrophilic C-terminus of yeast plasma-membrane Na+/H+ antiporters impacts their ability to transport K+. J Mol Biol. 436, 168443 (2024). IF = 5.6 DOI

 

Nová metoda pro určování spolehlivosti přenosu informace mezi nervovými buňkami (24.1. 2024)

Frekvenční kódování představuje základní hypotézu vysvětlující způsob přenosu informace mezi nervovými buňkami. Tato hypotéza je založena na pozorování, že průměrná četnost (frekvence) akčních potenciálů vzrůstá s intenzitou stimulace. Avšak přesné časy akčních potenciálů bývají proměnlivé i při zachování identických podmínek. Při vyhodnocování experimentálních dat i teoretických simulací je tedy nutné kvantifikovat variabilitu opakovaných záznamů, a posoudit tak spolehlivost frekvenčního kódováni. Variabilita neuronálních záznamů se obvykle měří pomocí tzv. Fano faktoru, jehož odhad je považován za problematický, zvláště při omezeném množství dat. V tomto článku navrhujeme novou metodu, pomocí níž je možné odhadnout Fano faktor přesněji než pomocí standardních metod, a to i v případě značné proměnlivosti stimulace v čase.

Rajdl K, Košťál L: Estimation of the instantaneous spike train variability. Chaos Solitons & Fractals. Roč. 177, December (2023), 114280. ISSN 0960-0779. E-ISSN 1873-2887 IF: 7.8 DOI

Jakým způsobem blokuje protein 14-3-3 aktivitu proteinkinasy CaMKK? (16.1. 2024)

Proteinkinasy CaMKK1 a CaMKK2 regulují klíčové fyziologické a patologické procesy, jako jsou nádorové bujení, morfogeneze neuronů, synaptická plasticita, aktivace transkripčních faktorů, homeostáza buněčné energie či podpora přežití buněk. Podařilo se nám objasnit strukturní podstatu inhibice obou CaMKK kinas prostřednictvím regulačních proteinů 14-3-3. Ukázali jsme, že vazba proteinu 14-3-3 na CaMKK1 i CaMKK2 brání jejich interakci s kalmodulinem, signální molekulou, která je nezbytná pro jejich aktivitu. Objasnění struktur komplexů 14-3-3 s CaMKK také odhalilo, že v případě CaMKK1 dochází navíc k  blokaci katalytického centra enzymu C-koncovými helixy proteinu 14-3-3. Naše zjištění mohou pomoci při vývoji nových léčiv cílených na inhibici CaMKK kinas.

Dimer proteinu 14-3-3 blokuje katalytické centrum CaMKK1 kinasy. Aktivní centrum kinasy je znázorněno pozicí inhibitoru (žlutě), fosforylační místa CaMKK1 jsou znázorněna červeně.

 

Petrvalska O+, Honzejkova K+, Koupilova N, Herman P, Obsilova V*, Obsil T.* 14-3-3 protein inhibits CaMKK1 by blocking the kinase active site with its last two C-terminal helices. Protein Sci. 32 (2023):e4805. ISSN 0961-8368. E-ISSN 1469-896X, IF: 8.000 DOI 

+ shared first authorship * shared corresponding autorship

Rizikové faktory pro vývoj kardiovaskulárních a metabolických onemocnění jsou spojené s nesprávně nastaveným spánkovým režimem (21.8. 2023)

Nejčastějším narušením cirkadiánních rytmů v moderní společnosti je tzv. sociální jetlag, tedy chronický nesoulad mezi biologickým časem (chronotypem) a sociálním časem (například vstávání podle budíku). Zda má sociální jetlag nějaké negativní účinky na zdraví, však není zcela jasné. Velká studie na reprezentativní dospělé populaci ČR provedená vědci z Oddělení biologických rytmů Fyziologického ústavu AV ČR a publikovaná v časopise Sleep odhalila rizikové faktory pro vývoj kardiovaskulárních a metabolických onemocnění, které jsou spojené s nesprávně nastaveným spánkovým režimem.

Autoři studie zkoumali unikátní populačně-reprezentativní soubor dat zahrnující 1957 krevních vzorků dospělých lidí z celé ČR s různými denními režimy (chronotypem). Ve vzorcích bylo analyzováno devět biomarkerů (cholesterol, krevní lipidy, glukóza, kortizol, a další) a byla zjištěna souvislost mezi sociálním jetlagem a biomarkery kardio-metabolického zdraví (hladinou celkového cholesterolu a LDL), která byla statisticky významná především u lidí starších 50 let. Autoři ve studii identifikovali i nové faktory ovlivňující sociální jetlag, jako je doba dojíždění do školy či zaměstnání nebo stres z nedostatku času. Studie také prokázala, že flexibilní pracovní doba účinně zmírňuje sociální jetlag.

 

Sládek M, Klusáček J, Hamplová D, Sumová A: Population-representative study reveals cardiovascular and metabolic disease biomarkers associated with misaligned sleep schedules. Sleep, Volume 46, Issue 6, June 2023, zsad037, IF: 5.6  DOI

Jak si buňky zajistí dostatek draslíku? (17.5. 2023)

Optimálně vysoká koncentrace draselných iontů je nezbytná pro mnoho buněčných procesů. Proto buňky používají celou řadu trasnportních proteinů s jejichž pomocí regulují vstup a výstup draselných iontů. Jedním z transportérů K+ do buněk je protein Trk1. S použitím kvasinkových buněk jsme prokázali, že velmi krátká část proteinu, smyčka IL2  a její dva konzervované zbytky (serin 882 a threonin 900) hrají důležitou úlohu jak ve správném poskládání proteinu při jeho vzniku, tak při regulaci aktivity proteinu v odpovědi na měnící se vnější koncentrace draselných iontů. Pro tuto regulaci je důležitá vazba regulačních proteinů nazývaných 14-3-3 na fosforylovaný threonin 900.

Proteiny 14-3-3 regulují aktivitu Trk1 vazbou na Thr900 ve druhé vnitrobuněčné smyčce proteinu.

 

Masaryk J, Kale D, Pohl P, Ruiz-Castilla F, Zimmermannová O, Obšilová V, Ramos J, Sychrová H: The second intracellular loop of the yeast Trk1 potassium transporter is involved in regulation of activity, and interaction with 14–3-3 proteins. Computational and Structural Biotechnology Journal. 21 (2023), 2705-2716. ISSN 2001-0370. E-ISSN 2001-0370, IF: 6.155 DOI

Teplo z kosterního svalu může chránit nejen proti chladu ale i proti obezitě (27.2. 2023)

Tisková zpráva

Tvorba tepla (termogeneze) je nezbytná pro udržování stálé tělesné teploty, a je významnou složkou energetického výdeje. K dobře popsaným mechanismům, které se podílejí na tvorbě tepla, patří svalový třes nebo netřesová termogeneze v hnědé tukové tkáni. Termogeneze v hnědém tuku, která je závislá na přítomnosti mitochondriálního proteinu UCP1 (odpřahující protein 1), je středem zájmu pro její možné využití k léčbě obezity. Další mechanismy netřesové termogeneze a jejich význam jsou relativně málo probádány.

Vědci z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR v Praze zkoumali tvorbu tepla u dvou různých kmenů laboratorních myší (C57BL/6J a A/J), které se liší náchylností k obezitě. U myší C57BL/6J lze obezitu vyvolat dietou s vysokým obsahem tuku, zatímco u  myší A/J obezita za těchto podmínek nevzniká. Myši obou kmenů se dokázaly aklimatizovat na chlad s jenom malým snížením tělesné teploty, přičemž pro termogenezi zpočátku využívaly svalový třes. Delší pobyt v chladu vedl u myší náchylných k obezitě k aktivaci termogeneze v hnědé tukové tkáni. Myši odolné k obezitě však překvapivě nedokázaly hnědou tukovou tkáň aktivovat, ale zvýšila se u nich netřesová termogeneze v kosterních svalech. Při tvorbě tepla ve svalech se uplatňovalo zvýšené cyklování iontů vápníku v endoplazmatickém retikulu spojené s vyšší oxidační aktivitou mitochondrií.

Zapojení odlišných termogenních mechanismů by mohlo souviset  s rozdílnou náchylností k obezitě.  Rezistence myší A/J k obezitě je asi dána jejich schopností aktivovat netřesovou termogenezi ve svalech. Tyto výsledky publikované v časopise Molecular Metabolism také naznačují novou možnost pro léčbu obezity aktivací netřesové termogeneze ve svalech. To je asi nadějnější způsob léčby obezity než případná terapie založená na zvýšení termogeneze v hnědé tukové tkáni. Zejména proto, že u dospělého člověka je kapacita kosterního svalu pro spalování tukových energetických zásob mnohonásobně vyšší než v hnědé tukové tkáni. Jen relativně malé zvýšení termogeneze ve svalu by tak mohlo významně omezit ukládání tukové tkáně. Způsob, jak takového zvýšení dosáhnout, je výzvou pro další výzkum.

 

Janovska, P., P. Zouhar, K. Bardova, J. Otahal, M. Vrbacky, T. Mracek, K. Adamcova, L. Lenkova, J. Funda, T. Cajka, Z. Drahota, S. Stanic, A. C. Rustan, O. Horakova, J. Houstek, M. Rossmeisl and J. Kopecky (2023). „Impairment of adrenergically-regulated thermogenesis in brown fat of obesity-resistant mice is compensated by non-shivering thermogenesis in skeletal muscle.“ Mol Metab 69: 101683. IF = 8.568 DOI

Dát si prášek ráno nebo večer? Stabilizátor nálady lithium ovlivňuje mozek různě v závislosti na denní době (30.1. 2023)

Tisková zpráva

Lithium je účinný stabilizátor nálady, ale mechanismus jeho terapeutického účinku není dobře znám. Tým prof. Sumové z Fyziologického ústavu AV ČR zkoumal vliv lithia na cirkadiánní hodiny umístěné v komplexu komorové bariéry obsahující choroidní plexus, který je součástí glymfatického systému celkově ovlivňujícího mozkovou funkci prostřednictvím produkce mozkomíšního moku. Zjistili, že léčba lithiem u myší změnila úroveň exprese hodinového genu v choroidálním plexu. K podrobnějšímu studiu účinku lithia použili model transgenní myši s cirkadiánním reportérem (mPer2LUC) ke sledování chodu hodin choroidálního plexu v reálném čase. Když aplikovali lithium na choroidní plexus izolovaný z těchto myší a kultivovali jej v in vitro podmínkách, účinek na hodiny byl vysoce závislý na načasování aplikace. Lithium zpožďovalo hodiny po většinu dne, ale během krátkého okna způsobilo fázový posun. Pomocí specifických inhibitorů autoři prokázali, že účinek nebyl zprostředkován inhibicí enzymu GSK3, tedy kanonickým mechanismem lithia, ale spíše modulací aktivity PKC. Výsledky naznačují nový mechanismus terapeutického působení lithia, které uvádí do souladu funkci glymfatického systému souvisejícího s hodinami choroidálního plexu s cyklem spánku a bdění, což může zlepšit funkci mozku u psychiatrických pacientů. Data argumentují pro personalizované načasování léčby lithiem u pacientů s bipolární depresí.

Liška K, Dočkal T, Houdek P, Sládek M, Lužná V, Semenovykh K, Drapšin M, Sumová A: Lithium affects the circadian clock in the choroid plexus – A new role for an old mechanism, Biomedicine & Pharmacotherapy, Vol. 159, March 2023, 114292, IF 7.419 DOI

Teplo nebo chlad? Nové poznatky o fungování iontových kanálů citlivých na změny teploty získané ve spolupráci s Univerzitou v Lundu (24.1. 2023)

Teplotně citlivé iontové kanály TRP jsou buněčnými molekulárními senzory zapojenými v přenosu smyslových signálů, vnímání bolesti (nocicepci) a udržování iontové homeostázy. Poruchy jejich funkce jsou příčinou mnoha závažných lidských onemocnění, jako jsou chronická bolest, zánět, rakovina a různá kardiovaskulární, neurologická, respirační, ledvinová a metabolická onemocnění. Očekávání vkládaná do vývoje nových léčiv zaměřených na tyto kanály zatím zůstávají nenaplněná vzhledem k jejich schopnosti být aktivován podněty různých modalit (polymodalitě), jejíž mechanismus stále není zcela objasněn. Mezinárodní tým vědců vedených Prof. Peterem M. Zygmundem (Lund University, Malmö, Sweden) ve spolupráci s vědci z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR v Praze objasnil dva důležité mechanismy přispívající k polymodální regulaci TRP kanálů. První studie odhalila vazebné místo a molekulární podstatu vazby D9‑tetrahydrocannabiorcolu (přírodního rostlinného kanabinoidu bez psychotropních účinků), který napomáhá aktivaci TRPV2, čímž ovlivňuje přenos bolestivých podnětů. Druhá studie identifikovala dvě samostatné specifické oblasti, které propůjčují jinému receptoru TRPA1 citlivost na teplo (> 35 °C) a chlad (< 15 °C), a prokázala, že teplotní citlivost tohoto receptoru rozhodujícím způsobem závisí na oxidačním a redukčním prostředí. Dosažené výsledky významně přispívají k pochopení obecných molekulárních mechanismů chemické a teplotní aktivace kanálů rodiny TRP a naleznou využití při hledání možných přístupů k jejich regulaci pomocí léčiv.

 

 

Vlevo: účinek chladu (15°C) na aktivaci lidského TRPA1 iontového kanálu přirozeného typu a mutantu, ve kterém je zaměněn hlavní aminokyselinový zbytek C856 zodpovědný za regulaci oxidačními a redukčními látkami. Kanály byly aktivovány sérií napěťových pulzů (od ‑160 mV do +200 mV).Vpravo: vizualizace struktury TRPA1 kanálu získaná kryoelektronovou mikroskopií (PDB: 6v9w) při pohledu ze strany a shora. Dynamické oblasti kanálu zodpovědné za aktivaci chladem jsou vyznačeny světle modrou barvou. Pozice cysteinu C856 je zobrazena na detailu struktury jedné podjednotky dole. 

Moparthi, L. - Sinica, Viktor - Moparthi, V. K. - Kreir, M. - Vignane, T. - Filipovic, M. R. - Vlachová, Viktorie - Zygmunt, P. M.The human TRPA1 intrinsic cold and heat sensitivity involves separate channel structures beyond the N-ARD domain. Nature Communications. Roč. 13, č. 1 (2022), IF: 17.694 DOI

Zhang, L. - Simonsen, Ch. - Zímová, Lucie - Wang, K. - Moparthi, L. - Gaudet, R. - Ekoff, M. - Nilsson, G. - Hellmich, U. A. - Vlachová, Viktorie - Gourdon, P. - Zygmunt, P. M. Cannabinoid non-cannabidiol site modulation of TRPV2 structure and function. Nature Communications. Roč. 13, č. 1 (2022), IF: 17.694, rok: 2021 DOI

Odhalení nových regulačních mechanismů v lidském antiporteru Na+/H+ NHA2 (14.11. 2022)

Sodno/protonové antiportery jsou membránové proteiny, které se nacházejí ve všech živých buňkách od bakterií až po člověka a hrají důležitou úlohu v regulaci pH a koncentrací kationtů uvnitř buněk. Mezi tyto typy transportérů patří i antiporter NHA2, jehož aktivita ovlivňuje řadu fyziologických funkcí, např. sekreci inzulínu, zpětné vstřebávání sodíku v ledvinách nebo pohyblivost spermií. Antiporter NHA2 transportuje přes membránu kationty Na+ nebo Li+ výměnou za H+ a jeho aktivita je specificky inhibována phloretinem. Vlastnosti a funkce všech proteinů přímo vyplývají z jejich složení, tedy ze sekvence aminokyselin, které protein tvoří. V rodině antiporterů Na+/H+ má NHA2 jedinečnou strukturu. Skládá se z 537 aminokyselin uspořádaných do 14ti transmembránových domén a unikátního hydrofilního N-konce dlouhého 82 aminokyselin, jehož struktura a funkce nebyly dosud studovány. V časopise Protein Science jsme publikovali objev nových prvků ve struktuře NHA2 důležitých pro jeho funkci, včetně odhalení významné regulační úlohy N-konce proteinu.

Lidský protein NHA2 a jeho mutantní varianty jsme studovali pomocí jeho exprese v buňkách modelového eukaryotního organismu, kvasince Saccharomyces cerevisiae, a také pomocí bioinformatických simulací (ve spolupráci s laboratoří Prof. Nira Ben-Tala z Univerzity v Tel-Avivu). Identifikovali jsme několik nových aminokyselinových zbytků důležitých pro selektivitu antiporteru (rozpoznání a transport kationtů Na+ a Li+) a pro transport protonů. Dále jsme určili místo ve struktuře proteinu, kam se váže inhibitor phloretin. Odhalili jsme také, že unikátní hydrofilní N-koncová část proteinu má důležitou (autoinhibiční) úlohu v regulaci transportní aktivity NHA2, protože zkrácení N-konce o prvních 50-70 aminokyselin vedlo až k dvojnásobnému zvýšení transportní aktivity proteinu. Dosažené výsledky také ukazují, že expresní systém NHA2 v buňkách kvasinek je možné v budoucnu využít např. pro rychlé zjištění, jak mutace vyskytující se v NHA2 v lidském genomu ovlivňují aktivitu antiporteru a/nebo pro testování nových látek ovlivňujících funkci NHA2 podobně jako phloretin.

 

Velazquez D., Prusa V., Masrati G., Yariv E., Sychrova H., Ben-Tal N. and Zimmermannova O. (2022): Allosteric links between the hydrophilic N-terminus and transmembrane core of human Na+/H+ antiporter NHA2. Protein Sci: e4460. IF = 6.993 DOI

Charakterizace nové látky pro léčbu obezity s nižšími vedlejšími účinky na metabolismus kostí (7.11. 2022)

Thiazolidindiony (TZD) jsou látky používané při léčbě diabetu, které zvyšují citlivost k inzulínu. První generace TZD však vykazuje řadu nežádoucích účinků, včetně např. zvýšené tvorby velkých tukových buněk (adipocytů) v kostní dřeni spojené s vyšším rizikem zlomenin a úbytku kostní hmoty. Předpokládá se, že tyto vedlejší účinky jsou do jisté míry způsobeny silnou vazbou TZD na jaderný receptor PPARγ. V nové studii publikované v časopise Molecular Metabolism jsme zkoumali, jak metabolismus v kostech ovlivní podávání látky MSDC-0602K, nového analoga TZD s nižší afinitou k receptorům PPARγ.

Zjistili jsme, že podávání MSDC-0602K obézním myším po dobu 8 týdnů vedlo ve srovnání s původními TZD k výrazně lepší kostní struktuře a vyšší pevnosti kostí spolu se zvýšeným podílem menších adipocytů v kostní dřeni. Zkoumali jsme také působení látky MSDC-0602K na molekulární úrovni pomocí pokusů s primárními tkáňovými kulturami. Mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně z myší ošetřených MSDC-0602K diferencovaly ve zvýšené míře do podoby osteoblastů (kostních buněk), nepodléhaly tolik stárnutí a vykazovaly zvýšený buněčný metabolismus glutaminu, který je důležitý pro tvorbu kostí (osteogenezi).

Ze studie vyplývá, že nový analog TZD by mohl ve srovnání s původními TZD zvyšovat citlivost k inzulínu s nižšími nežádoucími účinky na kvalitu kostí a metabolismus mezenchymálních kmenových buněk. Látka MSDC-0602K by tak mohla nahradit starší léčiva při léčbě metabolických a kostních onemocnění.

 

 

Benova, A., M. Ferencakova, K. Bardova, J. Funda, J. Prochazka, F. Spoutil, T. Cajka, M. Dzubanova, T. Balcaen, G. Kerckhofs, W. Willekens, G. H. van Lenthe, G. Alquicer, A. Pecinova, T. Mracek, O. Horakova, M. Rossmeisl, J. Kopecky and M. Tencerova (2022). "Novel thiazolidinedione analog reduces a negative impact on bone and mesenchymal stem cell properties in obese mice compared to classical thiazolidinediones." Mol Metab 65: 101598. IF = 8.568 DOI

Struktura steroidů zásadně ovlivňuje jejich vliv na aktivitu N-metyl-D-aspartátových receptorů (20.10. 2022)

N-metyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou proteiny, které se účastní regulace mnoha procesů v mozku savců. Hrají klíčovou roli při přenosu signálu mezi nervovými buňkami a i malé narušení funkce těchto receptorů může mít závažné následky pro zdraví člověka. Snížená funkce NMDA receptorů je spojována s neuropsychiatrickými poruchami jako je mentální retardace, snížený intelekt, schizofrenie, poruchy autistického spektra, epilepsie, nebo poruchy motoriky. Mezi látky, které dokáží napravit sníženou funkci NMDA receptorů patří například steroidy. Mechanismus účinku steroidů, kterým posilují funkci NMDA receptorů, však nebyl dosud popsán.

Ve studii publikované v časopise British Journal of Pharmacology jsme zjišťovali vliv nově syntetizovaných steroidů odvozených od neurosteroidu pregnanolon sulfátu na regulaci funkce NMDA receptorů. Ukázali jsme, že steroidy s krátkými alifatickými řetězci, jako je například pregnanolon karboxylát (PA-Car), inhibují funkci NMDA receptorů, zatímco steroidy s delšími řetězci, jako epipregnanolon butyrát (EPA-But), funkci NMDA receptorů posilují. Pomocí výsledků získaných z elektrofyziologických měření, molekulárně biologických metod a počítačového modelování jsme odhalili vazebné místo v transmembránové doméně NMDA receptoru, kam se váže EPA-But a navrhli jsme mechanismus, kterým EPA-But posiluje funkci NMDA receptorů.

 

 

(A) Vlevo: struktury pregnanolon karboxylátu (PA-Car) and epipregnanolon butyrátu (EPA-But). Vpravo: sloupcový graf ukazuje inhibiční působení PA-Car a posilující působení EPA-But na NMDA receptory. (B) Vazebné místo pro EPA-But (zelená molekula) se nachází na transmembránové doméně NMDA receptoru. Aminokyselinové zbytky, které se účastní interakce NMDA receptoru s EPA-But jsou zvýrazněny červeně.

Kysilov B, Hrcka Krausova B, Vyklicky V, Smejkalova T, Korinek M, Horak M, Chodounska H, Kudova E, Cerny J, Vyklicky L: Pregnane-based steroids are novel positive NMDA receptor modulators that may compensate for the effect of loss-of-function disease-associated GRIN mutations. British Journal of Pharmacology, (2022) 179:15, 3970–3990, IF = 9.473,  DOI

Iontový kanál TRPC5 jako cíl pro léčbu neuropatické bolesti (19.10. 2022)

Diabetickou neuropatii a neuropatii vyvolanou chemoterapií doprovází bolestivé stavy, jejichž možnosti léčby jsou, navzdory velkému pokroku v medicíně, nedostatečné. Tyto typy neuropatií se projevují bolestí vyvolanou chladem, kterou je v klinické praxi velmi obtížné zvládnout. Prozatím jediný lék, který úspěšně prošel klinickými studiemi a prokázal účinnost na tento typ bolesti, je duloxetin. Tento lék je účinnější než jiná antidepresiva s podobným mechanismem účinku při zvládání bolestivých neuropatií, ale není známo proč. Zaujalo nás, že u chladově citlivého iontového kanálu TRPC5 bylo v nedávné době prokázáno, že je exprimován v lidských senzorických neuronech a že inhibice jeho aktivity zmírňuje přetrvávající bolest, včetně neuropatické bolesti vyvolené chladem.

V naší studii jsme si položili otázku, zda je kanál TRPC5 modulován duloxetinem a zda může přispívat k jeho analgetickému účinku. Naše elektrofyziologická měření ukázala, že aktivita kanálu TRPC5 je duloxetinem silně tlumena. Díky molekulárnímu dokování a molekulárně dynamickým simulacím jsme nalezli možné vazebné místo duloxetinu. Tato vazebná kapsa na intracelulární straně transmembránové domény TRPC5 byla následně ověřena pomocí bodové mutageneze. Tvar a elektrostatické prostředí vazebné kapsy jsme mírně změnili nahrazením aminokyseliny glutamát 418 alaninem, což vedlo k úplné ztrátě účinku duloxetinu na aktivaci TRPC5 vyvolanou napětím. Naše výsledky naznačují, že TRPC5 představuje dříve nerozpoznaný molekulární cíl pro běžně používaný a vysoce účinný lék proti závažným formám bolesti.

 

 

Zimova L, Ptakova A, Mitro M, Krusek J,Vlachova V: Activity dependent inhibition of TRPC1/4/5 channels by duloxetine involves voltage sensor-like domain, Biomedicine & Pharmacotherapy. Roč. 152, August 2022, 113262, IF = 7,419, DOI

Nové druhy lipidů v mateřském mléce (29.7. 2022)

Kojení je nejlepší forma výživy pro novorozené dítě. Mateřské mléko obsahuje ideální koktejl živin a biologicky aktivních látek, které jsou nezbytné pro rychlý růst a vývoj v tomto časném období lidského života. Složení mléka je ovlivněno celou řadou faktorů, jako jsou například stravovací návyky matky, způsob porodu nebo délka těhotenství a důležitou otázkou neonatologické péče je právě optimální složení mléka pro nedonošené děti.

V naší studii jsme sledovali, jaký vliv má předčasný porod a nebo porod císařským řezem na kvalitu prvotního mléka – mleziva. Analýza vzorků od dárkyň mléka z Ústavu pro péči o matku a dítě v Praze Podolí ukázala, že oba typy porodu mají mírně nepříznivý dopad na složení mleziva. V těchto případech neměla mléčná žláza matky dostatek času k zahájení tvorby plnohodnotného mléka, ale s časem tento negativní vliv mizí a zralé mateřské mléko se podobá svým složením mléku matek s přirozeným porodem v termínu.

Ve všech vzorcích mateřského mléka jsme navíc objevili speciální lipidy zvané triacylglycerol estolidy, které slouží jako zásobárna protizánětlivých molekul. Zjistili jsme, že mléčný enzym karboxyl ester lipáza umí tyto složité molekuly štěpit, a uvolňovat tak látky s prospěšným účinkem na zdraví novorozence.

Brejchová K, Palůchová V, Březinová M, Čajka T, Balas L, Durand T, Křížová M, Straňák Z, Kuda O: Triacylglycerols containing branched palmitic acid ester of hydroxystearic acid (PAHSA) are present in the breast milk and hydrolyzed by carboxyl ester lipase, Food Chemistry. 2022; 388(Sep 15)); 132983, IF = 9.231 DOI

Rytmické chování matky podporuje vývoj biologických hodin plodu (27.5. 2022)

Než začnou samy tikat vnitřní biologické hodiny plodu v suprachiasmatických jádrech (SCN) hypotalamu, ovlivňuje funkci a vývoj této struktury rytmické chování matky. To bylo zjištěno v nové studii publikované týmem Aleny Sumové z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR 24. května v časopise PLOS Biology. Tento objev významně přispívá k pochopení vývoje vnitřních hodin a může nalézt uplatnění při léčbě předčasně narozených dětí.

SCN jsou centrálními hodinami v našem těle, poháněné rytmickým spínáním a vypínáním hodinových genů. Rytmická aktivita hodinových genů v buňkách SCN řídí aktivitu mnoha dalších genů lokálně i jinde v těle, což v konečném důsledku ovlivňuje širokou škálu cirkadiánních rytmů v chování, včetně příjmu potravy a spánku. Tato autonomní rytmická genová aktivita SCN však začíná relativně pozdě ve vývoji plodu, což vyvolává otázku, zda předtím než se vyvine, mohou genovou aktivitu v SCN ovlivňovat mateřské signály.

Aby autoři tuto otázku prozkoumali, porovnali denní profily genové aktivity v SCN z plodů vyvíjejících se u březích potkanů ​​držených ve tmě za dvou různých podmínek. Kontrolní skupina matek měla intaktní SCN a volný přístup k potravě, zatímco druhá skupina matek měla SCN chirurgicky odstraněné a měla omezený přístup k potravě na osm hodin denně, aby její pohybová aktivita vykazovala cirkadiánní rytmus i v nepřítomnosti centrálních hodin. Pomocí biostatistických analýz vědci zjistili, že v SCN plodů obou skupin existovala malá sada genů, jejichž načasování se mezi těmito dvěma skupinami lišilo, a mnohem větší soubor genů, jejichž aktivita oscilovala ve vzájemné synchronizaci. Mnohé z těchto genů mohly být přiřazeny ke dvěma hlavním neuronálním procesům. První odráží pokračující vývoj SCN a druhý nejranější projev jejich pozdější funkce. Data naznačují, že při vývoji fetálních SCN mohou mateřské stimuly nahradit chybějící mezibuněčnou synaptickou komunikaci a řídit rytmy buněčných populací dříve, než hodiny SCN plně dozrají. Nečekaná rozsáhlost a specifičnost reakce buněk SCN na mateřské signály zdůrazňuje důležitost fungujících biologických hodin matky během těhotenství a poukazuje na potenciální dopad absence takových signálů u předčasně narozených dětí.

Greiner P., Houdek P., Sládek M., Sumová A.: Early rhythmicity in the fetal suprachiasmatic nuclei in response to maternal signals detected by omics approach. PLOS Biology; DOI, IF 8.029 Published: May 24, 2022  

Nové poznatky o struktuře komplexu FOXO4: p53 – klíčového faktoru v regulaci stárnutí buněk (22.4. 2022)

Transkripční faktor p53 brání tomu, aby se vlivem stresu staly z normálních buněk buňky nádorové. Za stresových podmínek p53 interaguje s dalším transkripčním faktorem FOXO4 (Forkhead box O 4) a společně pak zvyšují produkci proteinu p21, což spouští proces stárnutí buňky (senescenci). Molekulární mechanismus zvyšování transkripce p21 je však stále nejasný. V práci  publikované v časopise Protein Science vědecké týmy Dr. Obšilové (FGÚ AV ČR), prof. Obšila (PřF UK a FGÚ AV ČR) a jejich kolegů z ÚOCHB AV ČR charakterizovali vzájemné interakce proteinů p53 a FOXO4 na molekulární úrovni. Nové poznatky o struktuře komplexu naleznou využití při vývoji specifických inhibitorů interakce mezi oběma proteiny, a následně pak při vývoji nových léčiv zaměřených na selektivní eliminaci senescentních buněk.

V této strukturní studii vědci provedli podrobnou charakterizaci interakcí v komplexu FOXO4:p53 pomocí integrovaného přístupu zahrnujícího analytickou ultracentrifugaci, nukleární magnetickou rezonanci a chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií. Protože FOXO4 i p53 mají více domén (viz. obrázek), studovali roli jednotlivých domén a neuspořádaných segmentů obou proteinů a zmapovali jejich interakční rozhraní. Zjistili, že zcela zásadní pro celkovou stabilitu komplexu p53:FOXO4 je interakce mezi transaktivační doménou TAD p53 a Forkhead doménou FOXO4. Na tvorbě komplexu se dále podílejí kontakty zahrnující N-koncový neuspořádaný segment FOXO4, C-koncovou negativní regulační doménu p53 a DNA-vazebné domény obou proteinů. Měřením vazby na DNA dále zjistili, že tvorba komplexu p53:FOXO4 blokuje vazbu p53 na DNA, aniž by však ovlivnila DNA-vazebné vlastnosti FOXO4.

 

Vlevo, analýza interakce mezi FOXO4 a p53 pomocí analytické ultracentrifugace, metodou sedimentační rychlosti. Uprostřed, změny v chemických posunech 15N-značeného FOXO4 v přítomnosti p53 získané z 1H-15N HSQC spekter namapované na krystalovou strukturu komplexu FOXO4 DBD:DNA. Vpravo, měření změn anisotropie fluorescence ukazující, že tvorba komplexu inhibuje vazbu p53 na DNA.

 

Mandal R, Kohoutova K, Petrvalska O, Horvath M, Srb P, Veverka V, Obsilova V and Obsil T. FOXO4 interacts with p53 TAD and CRD and inhibits its binding to DNA. Protein Sci. roč. 31, č. 5 (2022), č. článku e4287. IF = 6.725. DOI

Metabolomický atlas myši (14.1. 2022)

Orální glukózový toleranční test (OGTT) je nejběžněji používaným nástrojem na diagnostiku cukrovky z kapky krve. Pomocí něj můžeme sledovat schopnost organismu snížit hladinu cirkulující glukózy, která byla podána nalačno. Přestože jsou dynamické změny hladiny glukózy v krvi během OGTT dobře známy, málo se ví o metabolických změnách v cílových orgánech nebo o jejich vzájemné komunikaci. V naší studii jsme zkoumali, co se děje s molekulami cukru v jednotlivých orgánech a jak cukr ovlivňuje metabolické dráhy v těle. Proto jsme na myším modelu provedli OGTT s využitím glukózy značené stabilním izotopem uhlíku (13C), analyzovali jsme distribuci 13C6-glukózy v tkáních a sledovali časové profily metabolitů a lipidů napříč 12 orgány a v plasmě. Zjistili jsme, že se během OGTT využití glukózy zapíná na úrovni jednotlivých orgánů se specifickou kinetikou, ale substráty hladovění, jako je β-hydroxybutyrát, jsou “vypnuty” ve všech orgánech najednou. Časové profily 13C značených mastných kyselin a triacylglycerolů v tkáních naznačují, že se hnědá tuková tkáň může výrazně podílet na hladinách cirkulujících mastných kyselin paradoxně v momentě, kdy jsou hodnoty glukózy v plazmě nejvyšší. Vytvořili jsme virtuální interaktivní atlas metabolitů (cukrů, aminokyselin, lipidů..), který popisuje vzájemné vztahy mezi orgány po požití dávky cukru. Metabolický osud glukózy byl sledován ve 12 tkáních a plasmě.

Navštivte interaktivní webovou aplikaci, kde můžete virtuální myš prozkoumat sami.

Lopes M, Brejchova K, Riecan M, Novakova M, Rossmeisl M, Cajka T, Kuda O. Metabolomics atlas of oral 13C-glucose tolerance test in mice. Cell Rep. 2021 Oct 12;37(2):109833. DOI. PMID: 34644567 IF = 9,423

Účinnost opioidních analgetik je potlačena chemokinem CCL2 (8.12. 2021)

Opioidní analgetika jsou standardně využívána při léčbě závažných bolestivých stavů. Velmi obtížná je ale léčba neuropatických bolestí, které vznikají při poškození nervového systému a opioidní analgetika jsou zde často neúčinná. Je známo, že za těchto neuropatických stavů dochází na úrovni míchy k zánětu a zvýšené produkci určitých signálních molekul (chemokinů), jako je CCL2. Současná práce ukazuje, že chemokin CCL2 je jedním z důležitých faktorů významně snižujících účinnost analgetik působících přes opioidní receptory. Pravděpodobně působí jak přímo na neurony, tak přes aktivaci mikrogliových buněk. Léčba opioidními analgetiky je spojena také s celou řadou závažných nežádoucích účinků. Jedním z nich je i paradoxní zvýšená bolestivost – hyperalgezie, po podání opioidů. Tato práce ukazuje, že zmíněná nežádoucí hyperalgezie může být způsobena aktivací TRPV1 receptorů. Celkově publikované výsledky naznačují, že cestou ke zlepšení účinnosti léčby opioidními analgetiky, zejména při neuropatických stavech, by mohlo být současné ovlivnění funkce chemokinu CCL2 a TRPV1 receptorů.

Vliv CCL2 na utlumení bolestivého (nociceptivního) signálu opioidními agonisty v zadním rohu míšním. Kontrolní modrá křivka ukazuje, jak je synaptický přenos nociceptivního signálu po přidání látky DAMGO výrazně utlumen a zhruba po 13 minutách naopak posílen. DAMGO je agonista µ opiodních receptorů a napodobuje tedy účinek opiodních analgetik. Analgetický účinek DAMGO je však zcela potlačen v přítomnosti chemokinu CCL2 (červená křivka). Fialová křivka ukazuje, že CCL2 působí prostřednictvím mikrogliálních buněk, protože ztrácí svůj účinek, pokud jsou mikroglie blokovány přídavkem minocyklinu.

Chemokine CCL2 preventsopioid‑inducedinhibitionofnociceptivesynaptictransmission in spinalcorddorsalhorn. Mario Heles, Petra Mrozkova, Dominika Sulcova, Pavel Adamek, Diana Spicarova and Jiri Palecek, JournalofNeuroinflammation (2021) 18:279, DOI, IF=8.23

Oddělení výzkumu bolesti, Fyziologický ústav AV ČR, Akademie věd České republiky, Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4, Česká republika

Glifloziny – víc než jen antidiabetika (8.12. 2021)

Glifloziny se dnes běžně předepisují jako léčiva proti diabetu (pacienti možná budou znát např. empagliflozin pod obchodním názvem Jardiance). Glifloziny inhibují činnost transportéru pro sodík  a glukózu  v ledvinách, čímž zvyšují vylučování glukózy močí a pomáhají tak udržet hladiny krevního cukru. Vedle úlevy od zvýšené glykémie byla u pacientů pozorována i řada dalších příznivých účinků gliflozinů mj. snížení hmotnosti, krevního tlaku, či funkce ledvin a to nejen u lidí s diabetem ale i bez diabetu. Jak je to možné? Tady nastala ta pravá chvíle udělat krok zpět a charakterizovat účinky těchto léků znovu a důkladně u modelových zvířat. Výzkumný tým dr. Vaněčkové a její kolegové z dvou dalších oddělení z Fyziologického ústavu ve spolupráci s dr. Malínskou z IKEM zkoumali účinky empagliflozinu u různých nediabetických potkaních modelů vyznačujících se sklony k vysokému krevnímu tlaku (Ren-2 transgenní potkani, TGR) nebo k poruchám lipidového metabolismu (hereditárně triglyceridemičtí potkani). Ačkoli se přínos léčby u jednotlivých modelů v detailech lišil, dosažené výsledky ukazují, ze empagliflozin působí protizánětlivě, normalizuje hladiny krevních i tkáňových lipidů a u TGR potkanů navíc tlumí aktivitu sympatického nervového systému, čímž dochází ke snížení krevního tlaku. Tyto poznatky mohou v budoucnu přispět k rozšíření použití gliflozinu i na jiné diagnózy, než je stávající diabetes.

 

 

Hojná S, Rauchová H, Malínská H, Marková I, Hüttl M, Papoušek F, Behuliak M, Miklánková D, Vaňourková Z, Neckář J, Kadlecová M, Kujal P, Zicha J, Vaněčková I. Antihypertensive and metabolic effects of empagliflozin in Ren-2 transgenic rats, an experimental non-diabetic model of hypertension. Biomed Pharmacother. 2021 Dec;144:112246. Epub 2021 Oct 1. IF-5,98, DOI

Cílená modulace NMDA receptorů je klíčová pro efektivní léčbu neurologických a neurovývojových onemocnění (14.10. 2021)

N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou glutamátem aktivované iontové kanály, které se zásadně podílejí na excitačním synaptickém přenosu a jsou klíčové pro procesy učení a paměti. Jejich narušená funkce vede k závažným neurologickým, neurovývojovým a psychiatrickým chorobám jakými jsou například schizofrenie, poruchy autistického spektra, epilepsie či Alzheimerova choroba. Pro efektivní návrh nových léčiv schopných cíleně modulovat NMDA receptory je nezbytné detailně porozumět nejen struktuře receptoru na atomární úrovni, ale rovněž i odhalit konkrétní sekvenci konformačních změn, které se uplatňují při jeho aktivaci a alosterické modulaci.

Za využití metody single-molecule FRET jsme popsali a kvantifikovali sekvenci konformačních změn NMDA receptoru v jeho amino-terminální doméně, které za fyziologických podmínek vedou k aktivaci receptoru. V neposlední řadě jsme pak odhalili rozdílné úlohy receptorových podjednotek při aktivaci receptoru a identifikovali molekulární mechanismus, jakým snížení pH za patofyziologických podmínek (např. při mrtvici) vede ke snížení funkce receptoru.

Vyklický, Vojtěch - Stanley, Ch. - Habrian, Ch. - Isacoff, E. Y. Conformational rearrangement of the NMDA receptor amino-terminal domain during activation and allosteric modulation. Nature Communications. Roč. 12, č. 1 (2021), č. článku 2694. ISSN 2041-1723. E-ISSN 2041-1723, IF: 14.919, rok: 2020, DOI  

Strukturní podstata teplotní aktivace TRP kanálů (12.10. 2021)

TRPV3 je iontový kanál podílející se na detekci teplotních změn, bolesti, svědění, udržování kožní bariéry, hojení ran a růstu vlasů. Poruchy jeho funkce jsou příčinou mnoha závažných lidských kožních chorob, včetně genodermatózy známé jako Olmstedův syndrom, atopické dermatitidy, růžovky i psoriázy. Mezinárodní tým vědců vedených Prof. Alexandrem Sobolevským (Columbia University, New York, NY, USA) ve spolupráci s vědci z Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky v Praze zjistil, jak se mění TRPV3 kanál působením tepla, a určil molekulární podstatu jeho aktivace. Studie prokazuje, že otvírání TRPV3 teplotami překračujícími fyziologický práh (vyššími než 40 °C) zahrnuje změny sekundární struktury specifických oblastí proteinového komplexu kanálu, ale také aktivní účast membránových lipidů. Výsledek je důležitým příspěvkem k pochopení obecných molekulárních mechanizmů teplotní aktivace TRP kanálů a nezbytným předpokladem k vyhledávání možných přístupů jejich farmakologické regulace. O významu výzkumu těchto pozoruhodných bílkovinných komplexů svědčí nedávno udělená Nobelova cena za fyziologii a lékařství 2021, kterou získali dva američtí vědci David Julius a Ardem Patapoutian.

   

 

Vlevo: vizualizace přechodu mezi zavřeným a otevřeným stavem TRPV3 iontového kanálu při aktivaci teplem získaná kryoelektronovou mikroskopií. Vpravo, vizualizace přechodů mezi strukturami zavřeného, senzitizovaného a otevřeného stavu TRPV3 kanálu při aktivaci teplem. Dynamické oblasti zodpovědné za změny konformačních stavů jsou vyznačeny růžovou barvou, oblasti s nejvýraznějšími strukturními změnami jsou vyznačeny tmavě rudou barvou.

Nadezhdin, K. D. - Neuberger, A. - Trofimov, Yu. A. - Krylov, N. A. - Sinica, Viktor - Kupko, N. - Vlachová, Viktorie - Zakharian, E. - Efremov, R. G. - Sobolevsky, A. I. Structural mechanism of heat-induced opening of a temperature-sensitive TRP channel. Nature Structural & Molecular Biology. Roč. 28, č. 7 (2021), s. 564-572. ISSN 1545-9993. E-ISSN 1545-9985, IF: 15.369, rok: 2020, DOI

Načíst další