3D super-rozlišující fluorescenční mikroskopie s aplikací na studium morfologie mitochondriální sítě a mitochondriálních nukleoidů za fyziologických a patologických podmínek
Mitochondrie jsou semiautonomní organely a obsahující vlastní mtDNA. Ta je uložena v nukleoproteinových komplexech zvaných nukleoidy. Mitochondrie mají dále vlastní aparát pro expresi genů. Naše oddělení se zabývá studiem nukleoidů, jejich velikostí, dynamikou, replikací a interakcí s dalšími proteiny. Ke studiu velikosti mitochondrálních nukleoidů využíváme mikroskopů s vysokým rozlišením jako je FPALM kombinovaný s dSTORM, dále SIM nebo STED mikroskopii. Zabýváme se také vlivem overexprese nukleoidových proteinů na velikost a distribuci nukleoidů. Je zajímavé, že i velice krátké indukce exprese těchto proteinů zvětšují velikost nukleoidů a snižují schopnost jejich rovnoměrné distribuce. Jako nejlepší kombinace pro zobrazování mtDNA v super-rozlišení se jeví kombinace lokalizační mikroskopie s protilátkami. V případě použití protilátky specifické k mtDNA je průměrná velikost mitochondriálního nukleoidu asi 80 nm. Je fascinující, že do tohoto prostoru se musí vměstnat až 16,6 tisíce bazí dlouhá DNA spolu s DNA vazebnými proteiny, proteiny účastnícími se replikace, transkripce a oprav. V rámci tohoto tématu se také zajímáme životním cyklem mitochondriálních ribozomů, jenž s největší pravděpodobností začíná v blízkosti mitochondriálních nukleoidů a je ukončen mitofagií.
mtDNA/nukleoidy samostatně a lokalizované v mitochondriálním tubulu.
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) mitochondriální DNA a RNA
FISH je metoda, která pomocí krátkých úseků DNA s navázanými fluorescenčními molekulami umožňuje sledovat distribuci jednotlivých DNA a RNA v buňce v závislosti na jejich přesné sekvenci. V naší laboratoři zavádíme a optimalizujeme metody FISH pro super-rezoluční FPALM mikroskopii pro jednotlivé druhy mitochondriálních nukleových kyselin. To nám umožní zhodnotit distribuci a kinetiku jednotlivých druhů RNA v rámci mitochondriální sítě, a dále popsat ultrastrukturu mitochondriálních chromosomů – nukleoidů. Tento přístup bude významným krokem v poznání molekulární genetiky mitochondrií – pravděpodobně nejméně prozkoumaného odvětví molekulární genetiky, které v současné době stále nabývá na významu, především v souvislosti s výzkumem stárnutí a rakoviny.
Vizualizace mitochondriální 16S rRNA (červeně) pomocí FISH a mitochondriální DNA (zeleně) pomocí imunocytochemického značení s protilátkou proti DNA.
